Moderne Probenvorbereitung mit Ultraschallhomogenisatoren

SONOPULS im Praxistest für Lebensmittel und Gewebe

Dr. Cora Wunder
Institut für Rechtsmedizin, Abteilung Forensische Toxikologie, Frankfurt
Susanne Zellermann
Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, MV Standort Neubrandenburg
Dr. Kirsten Siebertz 
TDCLAB Dr. Siebertz GmbH

Keywords:
Probenvorbereitung, Homogenisierung, Extraktion, Ultraschallhomogenisator, Methodenvergleich, Gewebe, Lebensmittel

Die bisher angewandte Methode für das Homogenisieren von biologischen Proben wurde mit dem alternativ möglichen Einsatz eines SONOPULS-Ultraschallhomogenisators der Firma BANDELIN verglichen. Bei beiden Methoden wurden gute Reproduzierbarkeiten erzielt,  in Einzelfällen konnte eine augenscheinlich vollständigere Extraktion mittels Ultraschall erzielt werden. Ein großer Vorteil der Ultraschallhomogenisierung ist die leichte Handhabung und die schnelle Reinigung der Ultraschallsonotrode (Arbeitsspitze), weshalb die Ultraschallhomogenisierung in die Routine übernommen wird.

Einleitung
Die Zerkleinerung / Homogenisierung von biologischen Proben für die Vorbereitung der Analytik erfolgt traditionell sehr häufig mit einem mechanischen Zerkleinerungsstab. Es handelt sich um eine etablierte und in sich ausgereifte Methode. Das Betreiben des Gerätes erfordert jedoch einen hohen Zeitaufwand für das Montieren und Demontieren und insbesondere für die Reinigung, Verschleppungen von Probenmaterial im Inneren können nicht in jedem Fall ausgeschlossen werden. Die Homogenisierung mittels eines glatten Ultraschallstabs wird als alternative Methode angeboten und verwendet.
Abbildung 1 zeigt ein solches Gerät. Ultraschall wird in Wissenschaft und Technik für die vielfältigsten Anwendungen eingesetzt. Neben den bereits sehr verbreiteten Ultraschallbädern können mit Ultraschallhomogenisatoren besonders hohe Energiedichten in das Medium übertragen werden (bis zu 1500 W/cm2 gegenüber 1-5 W/cm2). Das Homogenisieren, Emulgieren, Suspendieren, Desagglomerieren verschiedenster Substanzen, das Beschleunigen chemischer Reaktionen oder das Aufschließen von Zellen sind im Bereich der Probenvorbereitung und –aufbereitung erprobte Einsatzgebiete.

Ultraschallhomogenisatoren sollen mit höherer Effizienz arbeiten, oft reproduzierbarere Ergebnisse produzieren und nicht zuletzt wesentlich leichter zu reinigen sein. Auch geringste Probenmengen sollen schnell, kostengünstig und reproduzierbar aufbereitet werden. Die Firma Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Marktführer im Bereich Ultraschallanwendungen im Labor, produziert und vertreibt neben den quasi flächendeckend in Laboren vorhandenen SONOREX-Ultraschallbädern SONOPULS-Ultraschallhomogenisatoren und stellte für die Vergleichstests probeweise ein Gerät zur Verfügung.
Mit den hier gezeigten Untersuchungen sollte in der Praxis geprüft werden, ob objektivierbare, qualitative Unterschiede der Homogenisierung an sich, bezüglich des Handlings und der Reproduzierbarkeit der nachfolgenden Analysen im Vergleich der beiden Methoden existieren.

Methoden
Die Ultraschall-Homogenisierung erfolgte mit dem Gerät SONOPULS HD 3100 bzw. HD 2200 der Firma Bandelin. Als Sonotroden dienten die Mikrospitze MS 73 und Kegelspitze KE 76. Teilweise wurden den Proben Glaskugeln zugesetzt und die Proben während der Behandlung gekühlt.

Homogenisierung von Gewebeproben in der forensischen Toxikologie
Werden Organproben (Gehirn, Leber und Lunge) in der forensischen Toxikologie auf das Vorhandensein von Arznei- oder Betäubungsmitteln untersucht, werden routinemäßig die Organe Gehirn, Leber und Lunge eingesetzt, wobei diese dann vorab homogenisiert werden müssen. In der Routine wird 1 g Organ eingewogen und anschließend mit 4 ml KH2PO4-Puffer (pH 6,0) versetzt. Bisher wurden die Organproben mit einem Ultraturrax homogenisiert, in der vorliegenden Studie sollte die Homogenisierung mittels Ultraschallhomogenisator verglichen werden. Im Detail wurde das Handling, die makroskopischen und mikroskopischen Bilder sowie die nachgängigen Analysenwerte der untersuchten Inhaltsstoffe bei unterschiedlichen Versuchsbedingungen (Ultraschall - US) 30 s, Ultraschall 180 s, Ultraturrax (UT) 45 s, US/UT je 30 s) betrachtet.

Bei der makroskopischen und mikroskopischen Betrachtung) führten für das relativ weiche Organ Gehirn beide Methoden zum gleichen Ergebnis der vollständigen Auflösung. Für die festeren Organe Lunge und Leber wurde gegenläufig beobachtet, dass makroskopisch der UT zum besseren Erfolg führte, denn mit Ultraschall verblieb ein nicht aufgelöstes Reststück in der Lösung, mikroskopisch jedoch ist eine wesentlich feinere Auflösung zu erkennen (siehe Abbildung 2).

In der nachfolgenden Analytik wurden repräsentativ die Werte von Fentanyl und Bromazepan sowie 6-MAM, Morphin und Codein betrachtet. Bei beiden Methoden wurden gute Reproduzierbarkeiten erzielt. Es gibt substanz- und gewebespezifische Ergebnis-Unterschiede, wobei die Ultraschallhomogenisierung im Vergleich zum Ultraturrax sowohl schlechtere als auch bessere Ergebnisse liefert. Die erhebliche Temperaturerhöhung bei länger dauernder Beschallung ohne Eiskühlung von bis zu 20 Grad (vom Hersteller wird allerdings auch eine Kühlung mittels Eisbad empfohlen) führt erstaunlicherweise auch bei der hydrolyseempfindlichen Substanz Monoacetylmorphin nicht zu Problemen, sodass der Temperatureinfluss nicht von erheblicher Bedeutung sein kann. Nichtsdestotrotz wird erwogen, zur Sicherheit im Eisbad zu arbeiten.

Homogenisator SONOPULS Serie 4000

Ergebnisse  Ultraschall Ultraturrax
Handhabung leichte Handhabung komplizierteres Zusammenbauen
  schnelle Reinigung umständliche Reinigung nur durch Auseinanderbauen
Homogenisierung starker Temperaturanstieg bei längerer Beschallung ohne Eisbad Keine Temperaturerhöhung
  Gewebe wie Leber und Lunge werden nur ansatzweise zerkleinert Allgemein gute mechanisch Zerkleinerung, Probleme bei stark bindegewebshaltigem Material
  Bei flüssigeren Geweben wie Gehirn leichte und schnelle Homogenisierung
  Mikroskopisch feinere Homogenisierung Mikroskopisch gröbere Homogenisierung
Eingelagerte Substanzen Substanz- und materialabhängige Konzentrationsunterschiede
  gute Reproduzierbarkeit

Fazit:
Insgesamt sind die Ergebnisse der Ultraschallhomogenisierung vergleichbar mit denen des Ultraturrax. Aufgrund dessen wäre der Einsatz der Ultraschallhomogenisierung in der Praxis gut vorstellbar und kann als Ersatz der mechanischen Gewebezerkleinerung (Ultraturrax) dienen. Ein großer Vorteil der Ultraschallhomogenisierung ist die leichte Handhabung und die schnelle Reinigung des Ultraschallstabes. Die Übernahme der Ultraschallmethode in die Routine findet aktuell statt.

Abbildung 2, Mikroskopische Befunde:

Gehirn-Ultraschall 180 Sek. auf Eis

Lunge-Ultraschall 180 Sek. auf Eis

Lunge-Ultraschall 30 Sek. auf Eis

Abbildung 2, Mikroskopische Befunde:

Gehirn-Ultraturrax

Leber-Ultraturrax

Lunge-Ultraturrax

Homogenisierung in der Lebensmittelüberwachung

Insbesondere pastenartige, fetthaltige Lebensmittel sind konventionell schwierig aufzuarbeiten. Die Ultraschallhomogenisierung wurde somit an Frischkäse bzw. Schmelzkäse für 3 nachgängige repräsentative Bestimmungen mit der jeweiligen konventionellen Methode der Homogenisierung verglichen.

Vergleich mit Reibschale: Zur Bestimmung des Nitratgehaltes in Käse nach dem Xylenolverfahren (L 01.00-36) wurden jeweils 5 g Probe wurden mittels einer Reibschale mit warmem Wasser verrieben bzw. 2 min mittels US-Homogenisator in 15 ml Wasser behandelt. Die erhaltenen Analysenergebnisse (8 Messwerte) sind vergleichbar sowohl hinsichtlich der absoluten Werte als auch hinsichtlich der Standardabweichung.

Insbesondere durch das mehrfache Nachspülen bei der konventionellen Methode können Verluste beim Überführen in den Maßkolben auftreten. Dieser Vorgang erfordert auch viel direkte Handarbeit, die bei der Nutzung des Ultraschall-Homogenisators entfällt.

Vergleich mit Ultraturrax: Zur Bestimmung des Chloridgehaltes in Käse mittels Potentiometrie wurde ca. 1 g Probenmaterial in 50 ml Wasser überführt und mit einem Ultraturrax sowie mit dem Ultraschallhomogenisator behandelt. Auch wenn der Mittelwert bei Anwendung des Ultraschallhomogenisators geringgradig unter dem der konventionellen Methode liegt, führt der Vergleich zu zufriedenstellenden Ergebnissen.

Bei der konventionellen Methode ist die Reinigung des Ultra-Turrax-Stabes durch das notwendige Zerlegen und wieder Zusammenbauen relativ aufwändig. Die US-Sonotrode muss dagegen nur abgespült werden.

Vergleich mit Ultraschallbad: Zur Bestimmung des Sorbinsäuregehaltes in Frischkäse (HPLC-DAD) in Anlehnung an L00.00-09 wurde 1g Probe mit Extraktionslösung (Methanol/Wasser) versetzt und 10 min im Ultraschallbad bei 40 °C bzw. 2 min mittels Ultraschallhomogenisator vor dann gleicher Weiterverarbeitung behandelt.

Auch bei diesem Verfahren ist die Aufarbeitung mit dem Ultraschallhomogenisator einfacher. Der erhaltene Mittelwert (8 Messwerte) liegt etwas über dem der konventionellen Methode. Ursächlich ist dabei die verbesserte Extraktionsleistung mit der US-Sonotrode zu sehen.

 Homogenisieren von Frischkäse

Fazit:

  • Das Handling mit der Sonotrode ist sehr einfach - es ist nur ein Eintauchen der Spitze notwendig.
  • Auch die Reinigung und gegebenenfalls Desinfektion sind durch einfaches Abspülen und Abwischen
        möglich, das Gerät ist schnell wieder einsatzbereit.
  • Die Extraktion mit der Ultraschall-Kegelspitze führt zu vergleichbaren und bei Sorbinsäure sogar zu
        höheren Ergebnissen.
  • Es sollten tendenziell möglichst hohe und schmale Gefäße verwendet werden, um eventuelles
        Verspritzen, abhängig von der eingestellten Energieleistung, zu vermeiden.
  • Trotz Verwendung einer Lärmschutzbox ist insbesondere bei Dauerbetrieb eine deutliche Lärmbelastung       vorhanden, gegebenenfalls ist die Nutzung von weiterem Gehörschutz nötig.
  • Insgesamt besteht seitens der Mitarbeiter eine hohe Akzeptanz hinsichtlich der Nutzung dieses Gerätes.
        Es wurde direkt zur Nutzung in die Routine überführt.

Ausblick:

Es werden weitere Anwendungsmöglichkeiten geprüft, z.B. die Herstellung von Extrakten für die Bestimmung von Staphylokokkenenterotoxinen. Die bisherige Methode ist problematisch, weil eine hohe Einwaage mit relativ wenig Extraktionsmittel homogenisiert werden muss. Erste Ergebnisse zeigen, dass der Ultraschallhomogenisator deutlich gleichmäßigere Extrakte liefert als Ultraturrax bzw. Stomacher.

Schlussfolgerungen für den praktischen Einsatz eines Ultraschallhomogenisators in der Probenvorbereitung für die chemische Analytik

Vergleichbare reproduzierbare Analysenergebnisse
In beiden Anwendungsfeldern, in denen die Homogenisierung und Extraktion in der Probenvorbereitung eine sehr große Rolle spielen, konnten zu konventionellen Methoden vergleichbare und in sich reproduzierbare Analysenergebnisse erzielt werden. Erstaunlicherweise war die Extraktion auch vollständig, wenn makroskopisch noch nicht 100 % der Probenmatrix zerkleinert sind.

Vollständigere Extraktionen möglich
In einzelnen Fällen werden reproduzierbare höhere Werte erhalten, was auf eine vollständigere Extraktion zurückzuführen ist.

Gleichmäßigere Extrakte bei hohem Proben-Extraktionsmittel-Verhältnis
Durch die stufenlose Variabilität des Energieeintrags mit dem Ultraschallhomogenisator kann man die Bedingungen dafür sehr gut anpassen.

Gute Verwendung bei kleinen Probenmengen
Durch die mögliche Verwendung von Mikrospitzen (beispielsweise auch Anwendung im Eppendorf-Cup möglich) sind auch sehr kleine Probenmengen gut zu behandeln.

Wesentlich leichtere Reinigung und Desinfektion möglich, wesentlich geringere Gefahr von Probenverschleppung
Es handelt sich bei allen Sonotrodenformen um eine glatte Oberfläche ohne Ritzen o.ä..

Große Variabilität für Anpassung der Bedingungen an die Anforderungen
Durch den Einsatz von Sonotroden verschiedener Bauform bei unterschiedlichen Amplituden und Energiedichten sowie unterschiedlich langen Beschallungszeiten bestehen sehr viele Möglichkeiten, die Methode für die Anforderungen an die jeweilige Matrix usw. anzupassen. Eine Sammlung zu bewährten Anwendungen in der Praxis liegt vor.

Ohne Kühlung Temperaturerhöhungen bei längeren Beschallungszeiten
Es kommt zu erheblichen Temperaturerhöhungen bei längerer Beschallung mit hohen Energiedichten, was aber nicht zwingend zu Problemen führt und einfach verhindert werden kann, wenn die Probengefäße im Eisbad stehen oder die Beschallungszeit und Energie optimiert wird.

Nicht unerhebliche Geräuschentwicklung, Schutzmaßnahmen sinnvoll
Die entstehenden Geräusche (bekannt vom Ultraschallbad) sind nicht so sehr laut, aber werden als eher unangenehm empfunden. Der Einsatz einer Lärmschutzbox und ggf. Gehörschutz ist sinnvoll.

Gesamtfazit

Insgesamt überwiegen im Vergleich der Ultraschallhomogenisierung zu konventionellen Methoden nach Ansicht der Praxisanwender bei weitem die Vorteile gegenüber den Nachteilen und es besteht eine hohe Akzeptanz im Labor, so dass die Methoden nach den Praxistests in beiden Anwendungsbereichen in die Routine übernommen werden.

Diese Anwendungen können generell als beispielhaft für andere Probenmatrices angesehen werden. Nichtsdestotrotz ist der individuelle Test immer empfohlen. Die Geräte können nach Anforderung im eigenen Labor oder in Anwender-/Fortbildungsseminaren mit eigenen Proben getestet werden.

Kontakt:

Dipl.-Ing.
Marina Herrmann
Vertriebsleitung
Labor-Ultraschall
Telefon +49 30 76880-18
E-Mail: Marina.Herrmann@bandelin.com