Préparation moderne d'échantillons avec des homogénéisateurs à ultrasons

SONOPULS tests pratiques sur des échantillons d'aliments et de tissus

Dr. Cora Wunder
Institut de médecine légale, Département de toxicologie médico-légale, Francfort
Susanne Zellermann
Bureau d'État pour l'agriculture, la sécurité alimentaire et les pêches, MV location Neubrandenburg
Dr. Kirsten Siebertz 
TDCLAB Dr. Siebertz GmbH

Mots clés:
Préparation d'échantillons, homogénéisation, extraction, homogénéisateur à ultrasons, comparaison de méthodes, tissus, aliments

La méthode précédemment utilisée pour l'homogénéisation d'échantillons biologiques a été comparée avec l'utilisation alternative possible d'un homogénéisateur à ultrasons SONOPULS de BANDELIN. Dans les deux cas, une bonne reproductibilité a été obtenue, dans certains cas une extraction apparemment plus complète a pu être réalisée au moyen d'ultrasons. Un grand avantage de l'homogénéisation par ultrasons est la facilité de manipulation et le nettoyage rapide de la sonotrode à ultrasons (pointe de travail), ce qui explique pourquoi l'homogénéisation par ultrasons est préférée dans la routine.

Introduction
La fragmentation / homogénéisation des échantillons biologiques pour la préparation de l'analyse est traditionnellement effectuée très souvent avec une baguette de broyage mécanique. C'est une vieille méthode établie. Le fonctionnement de l'appareil nécessite toutefois beaucoup de temps pour le montage et le démontage, et en particulier pour le nettoyage. De plus, le transfert de l'échantillon à l'intérieur de l'appareil ne peut pas toujours être évité. L'homogénéisation au moyen d'une tige à ultrasons lisse est proposée et utilisée comme méthode alternative.
La figure 1 montre un tel dispositif. L'ultrason est utilisé dans la science et la technologie pour les applications les plus diverses. En plus des cuves à ultrasons déjà largement utilisées, les homogénéisateurs à ultrasons peuvent transmettre des densités d'énergie particulièrement élevées dans le milieu (jusqu'à 1500 W / cm2 comparé à 1-5 W / cm2). L'homogénéisation, l'émulsion, la mise en suspension, la désagglomération de diverses substances, l'accélération de réactions chimiques ou la rupture de cellules sont des domaines d'application éprouvés dans le domaine de la préparation et de la préparation d'échantillons.

Les homogénéisateurs à ultrasons sont censés fonctionner avec une plus grande efficacité, produisent souvent des résultats plus reproductibles et, enfin, beaucoup plus faciles à nettoyer. Même les plus petites quantités d'échantillons sont traitées rapidement, de manière rentable et reproductible. La société Bandelin electronic GmbH & Co. KG, leader dans le domaine des applications ultrasonores en laboratoire, produit et commercialise les homogénéisateurs ultrasoniques SONOPEX en plus des cuves à ultrasons SONOREX, disponibles dans les laboratoires, et a fourni un test pour les tests de comparaison.
Avec les recherches présentées ici, il convient d'examiner dans la pratique si des différences qualitatives de l'homogénéisation en soi, en ce qui concerne la manipulation et la reproductibilité des analyses suivantes, existent dans la comparaison des deux méthodes.

Méthodes
L'homogénéisation par ultrasons a été réalisée en utilisant le SONOPULS HD 3100 ou HD 2200 de Bandelin. La pointe conique MS 73 et la pointe micro KE 76 ont été utilisées comme sonotrodes, des billes de verre ont été partiellement ajoutées aux échantillons et les échantillons ont été refroidis pendant le traitement.

Homogénéisation des échantillons de tissus en toxicologie médico-légaleSi des échantillons d'organes (cerveau, foie et poumon) en toxicologie médico-légale sont examinés pour la présence de drogues ou de stupéfiants, les organes cérébraux, hépatiques et pulmonaires sont couramment utilisés, qui doivent ensuite être homogénéisés à l'avance. Dans la routine, 1 g d'organe est pesé puis traité avec 4 ml de tampon KH2PO4 (pH 6,0). Jusqu'à présent, les échantillons d'organes ont été homogénéisés avec un Ultraturrax, dans la présente étude on le compare à l'homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur à ultrasons. Dans le détail, la manipulation, les images macroscopiques et microscopiques ainsi que les valeurs d'analyse subséquentes des ingrédients examinés ont été considérées dans différentes conditions expérimentales (ultrasons - US) 30 s, ultrasons 180 s, Ultraturrax (UT) 45 s, US / UT toutes les 30 s).

À l'observation macroscopique et microscopique, les deux méthodes ont donné le même résultat de résolution complète pour le cerveau d'organe relativement mou. Pour les organes plus fermes du poumon et du foie, il a été observé dans des directions opposées que macroscopiquement l'UT a conduit à un meilleur succès, car avec les ultrasons un résidu non résolu restait dans la solution, mais une résolution beaucoup plus fine peut être observée (voir Figure 2).

Dans l'analyse suivante, des valeurs représentatives du fentanyl et du bromazépan ainsi que de la 6-MAM, de la morphine et de la codéine ont été considérées. Les deux méthodes ont obtenu une bonne reproductibilité. Il existe des différences de résultats entre les substances et les tissus, l'homogénéisation par ultrasons offrant des résultats à la fois meilleurs et moins bons que ceux d'Ultraturrax. L'augmentation considérable de la température pendant une irradiation prolongée sans refroidissement de la glace jusqu'à 20 degrés (le fabricant recommande également le refroidissement par bain de glace) ne provoque pas de problème avec la monoacétylmorphine sensible à l'hydrolyse. Néanmoins, il est considéré de travailler pour la sécurité avec un bain de glace.

Homogenisator SONOPULS Serie 4000

Ergebnisse UltraschallUltraturrax
Handhabungleichte Handhabungkomplizierteres Zusammenbauen
 schnelle Reinigungumständliche Reinigung nur durch Auseinanderbauen
Homogenisierungstarker Temperaturanstieg bei längerer Beschallung ohne EisbadKeine Temperaturerhöhung
 Gewebe wie Leber und Lunge werden nur ansatzweise zerkleinertAllgemein gute mechanisch Zerkleinerung, Probleme bei stark bindegewebshaltigem Material
 Bei flüssigeren Geweben wie Gehirn leichte und schnelle Homogenisierung
 Mikroskopisch feinere HomogenisierungMikroskopisch gröbere Homogenisierung
Eingelagerte SubstanzenSubstanz- und materialabhängige Konzentrationsunterschiede
 gute Reproduzierbarkeit

Résultat:
Globalement, les résultats de l'homogénéisation par ultrasons sont comparables à ceux de l'Ultraturrax. Pour cette raison, l'utilisation de l'homogénéisation par ultrasons serait bien concevable dans la pratique et pourrait servir de substitut à la fragmentation tissulaire mécanique (Ultraturrax). Un grand avantage de l'homogénéisation ultrasonique est la manipulation facile et le nettoyage rapide de la tige à ultrasons. Le transfert de la méthode par ultrasons dans la routine est en cours.

Illustration 2, résultats au microscope:

Ultrason / Cerveau 180 secondes sur glace

Ultrason / Poumon 180 sec sur glace

Ultrason / Poumon 30 secondes sur glace

Abbildung 2, Mikroskopische Befunde:

Ultraturrax / Cerveau

Ultraturrax / Foie

Ultraturrax / Poumon

Homogénéisation pour la surveillance des aliments

Les aliments gras et pâteux en particulier sont généralement difficiles à traiter. L'homogénéisation par ultrasons a donc été comparée sur fromage frais et sur fromage fondu pour 3 déterminations représentatives ultérieures avec la méthode d'homogénéisation conventionnelle respective.

Comparaison avec le mortier: Pour déterminer la teneur en nitrate du fromage par la méthode au xylénol (L 01.00-36), 5 g de l'échantillon ont été triturés avec de l'eau chaude au mortier ou traités dans 15 ml d'eau pendant 2 min au moyen d'un homogénéisateur américain. Les résultats analytiques obtenus (8 valeurs mesurées) sont comparables en termes de valeurs absolues et d'écart-type.

En particulier par le rinçage multiple de la méthode conventionnelle, des pertes peuvent survenir lors du transfert vers un ballon jaugé. Ce processus nécessite également beaucoup de travail manuel direct, qui est éliminé lors de l'utilisation de l'homogénéisateur à ultrasons.

Comparaison avec Ultraturrax: Pour déterminer la teneur en chlorure dans le fromage par potentiométrie, environ 1 g d'échantillon a été transféré dans 50 ml d'eau et traité avec un Ultraturrax et avec l'homogénéisateur à ultrasons. Même si la valeur moyenne lors de l'utilisation de l'homogénéisateur à ultrasons est légèrement inférieure à celle de la méthode conventionnelle, la comparaison conduit à des résultats satisfaisants.

Dans la méthode conventionnelle, le nettoyage de la tige Ultraturrax par le démontage et le remontage nécessaires est relativement coûteux. La sonotrode américaine, cependant, a seulement besoin d'être rincée.

Comparaison avec une cuve à ultrasons: Pour déterminer la teneur en acide sorbique du fromage blanc (HPLC-DAD) sur la base de L00.00-09, 1 g d'échantillon a été mélangé avec une solution d'extraction (méthanol / eau) et prétraité pendant 10 min dans un bain ultrasonique à 40 ° C ou 2 min au moyen d'un homogénéisateur à ultrasons avant de poursuivre avec le même traitement.

Aussi dans cette méthode, le traitement est plus facile avec l'homogénéisateur à ultrasons. La valeur moyenne obtenue (8 valeurs mesurées) est légèrement supérieure à celle de la méthode conventionnelle. Les performances d'extraction sont enfait améliorées grâce à la sonotrode américaine.

Homogénéisation du fromage frais

Conclusion :

  • La manipulation avec la sonotrode est très simple - il suffit de tremper la pointe.
  • Le nettoyage et la désinfection sont possibles par simple rinçage et essuyage, l'appareil est rapidement prêt à être utilisé à nouveau.
  • L'extraction avec la pointe conique à ultrasons conduit à des résultats comparables voire même supérieurs à ceux obtenus avec l'acide sorbique.
  • Utilisez des récipients aussi hauts et étroits que possible pour éviter les éclaboussures, en fonction de la performance énergétique.
  • Malgré l'utilisation d'une boîte anti-bruit, une pollution sonore importante est présente, en particulier pendant le fonctionnement continu, l'utilisation d'une protection auditive supplémentaire peut être nécessaire.
  • Dans l'ensemble, les employés adhèrent vite à l'utilisation de cet appareil et il est directement adopté dans la routine.

Pespectives d'application :

D'autres applications sont à l'étude, par exemple la préparation d'extraits pour la détermination des entérotoxines staphylococciques. La méthode précédente est problématique car un poids initial élevé doit être homogénéisé avec relativement peu d'agent d'extraction. Les premiers résultats montrent que l'homogénéisateur à ultrasons délivre des extraits nettement plus uniformes que Ultraturrax ou Stomacher.

Conclusions pour l'utilisation pratique d'un homogénéisateur à ultrasons dans la préparation d'échantillons pour l'analyse chimique

Résultats d'analyse reproductibles comparables
Dans les deux domaines d'application, où l'homogénéisation et l'extraction dans la préparation des échantillons jouent un rôle très important, des résultats analytiques comparables et reproductibles peuvent être obtenus avec des méthodes conventionnelles. De façon surprenante, l'extraction était également complète alors que pas encore 100% de la matrice de l'échantillon était broyé.

Extractions plus complètes possibles
Dans certains cas, des valeurs plus élevées reproductibles sont obtenues, ce qui est dû à une extraction plus complète.

Des extraits plus uniformes avec un fort ratio échantillon-extractant
En raison de la variabilité infinie de l'apport d'énergie avec l'homogénéisateur à ultrasons, vous pouvez très bien ajuster les conditions.

Utilisation optimale de petites quantités d'échantillon
En raison de l'utilisation possible de micropointes (par ex. Également possible dans l'Eppendorf-Cup), même de très petits volumes d'échantillons peuvent être bien traités.

Nettoyage et désinfection beaucoup plus faciles, réduction significative du risque de transfert d'échantillons
Toutes les formes de sonotrode sont une surface lisse sans fissures ou autre.

Grande variabilité pour adapter les conditions aux exigences
Grâce à l'utilisation de sonotrodes de conception différente avec différentes amplitudes et densités d'énergie ainsi que différentes durées de sonification, il existe de nombreuses possibilités d'adapter la méthode aux exigences de la matrice correspondante, etc. Un répèrtoire des pratiques approuvées dans le domaine est disponible.

Sans refroidissement, les températures augmentent lors de longues périodes de sonification
Il y a des augmentations de température considérables pendant une sonification prolongée avec des densités d'énergie élevées, mais cela ne conduit pas nécessairement à des problèmes et peut être facilement évité si les récipients sont dans un bain de glace ou si le temps et l'énergie sont optimisés.

Développement non insignifiant du volume sonore, mesures de protection utiles
Le bruit résultant (connu des cuves à ultrasons) n'est pas si fort, mais est perçu comme plutôt désagréable. L'utilisation d'une boîte anti-bruit et éventuellement d'une protection auditive est à considérer.

Conclusion générale

Dans l'ensemble, les avantages de homogénéisation par ultrasons, en comparaison avec les méthodes conventionnelles, dépassent de loin les inconvénients. De plus on atteste d'une forte acceptation en laboratoire, de sorte que les méthodes sont vite adoptées après les tests pratiques comme partie intégrante de la routine, dans les deux domaines d'applications.

Ces applications peuvent généralement être considérées comme exemplaires pour d'autres matrices d'échantillons. Néanmoins, le test individuel est toujours recommandé. Les appareils peuvent être testés sur demande dans notre propre laboratoire ou dans des séminaires avec nos propres échantillons.

Contact:

Ingénieur diplomée
Marina Herrmann
Direction des ventes
Ultrasons en laboratoire
Téléphone +49 30 76880-18
E-Mail: Marina.Herrmann@bandelin.com